一种简便的适合抱卵孵化甲壳动物的转基因方法

一种简便的适合抱卵孵化甲壳动物的转基因方法

研究背景：转基因动物已广泛应用于基础研究、疾病动物模型的建立、药用蛋白质的生产、农业（转基因家畜的生产）等各个领域，既具有深远的理论意义，又有重大的应用价值，因而近年来成为生物工程领域的研究热点之一。转基因动物的研究在哺乳动物和其它脊椎动物中较多，也比较深人，而在无脊椎动物中研究较少，而对于甲壳类动物这方面的研究更少。1996年，刘萍等通过将外源基因注射到亲虾的纳精囊，在中国对虾中获得了大于1%的转基因率。刘志毅等用基因枪轰击受精卵在中国对虾(Penaeus chinensis)中获得了60.7%的转移率。然而罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)等许多经济甲壳类动物，由于它们的胚胎都是附着在母体的腹部刚毛上进行孵化的，而且每次产出的卵的数量很大，显微注射胚胎等方法显然不可行，电穿孔法又需要复杂的仪器，很不方便，这给该类动物遗传发育理论的深人研究和育种工作的开展带来了难题，使得对此类动物的分子水平的研究处于相对滞后的水平。

实验对象：包括罗氏沼虾在内的许多甲壳类动物交配时，雄体排出的精子并不游离，而是被输精管的腺上皮细胞所分泌的物质包裹，形成小囊，称为精荚(spermato-phore)，精荚内含有大量精子，雄体在交配时将精荚授予雌体。以罗氏沼虾为例，成熟的雌性罗氏沼虾在生殖蜕皮后进行交配，雄虾将精荚授予雌虾，精荚附着在雌虾头胸甲腹面第三、四、五对步足基部之间。一般交配后数小时至十几小时内雌虾排卵。卵子由第三对步足基部的生殖孔排出，在刚毛的作用下经过第四、五对步足之间到达雌虾腹部的抱卵腔，在经过精荚处时，精荚破裂，精卵结合受精。由于这一特性，可获得充足的时间对罗氏沼虾的精荚进行处理，使其中的精子成为携带外源基因的载体。

实验方法：1.罗氏沼虾的饲养：罗氏沼虾用玻璃缸或大塑料水箱饲养，水温逐渐升高并恒定在28℃左右，充气泵增氧，日换水量大于二分之一。每日投喂碎肉或煮熟的玉米渣、小米等。一旦看到雌虾生殖蜕皮并在胸部腹面附有精荚时，将其单独饲养，准备注射。

2.  
精荚微注射：将纯化好的带有云杉卷叶蛾抗冻蛋白基因的质粒按照设定的浓度用PBS配好待用。用纱布裹住雌虾背部，轻轻握在手中，由于雌虾刚刚经过生殖蜕皮，其甲壳较软，不会有太大挣扎。右手持微量注射器，将针管里的2μL质粒DNA溶液以水平方向注射人雌虾腹部的精荚内，拔出针后，稍等待一会，再将虾放入饲养缸。设定了5个注射量的梯度，注射质粒DNA总量分别为：250ng、500ng、1000ng、1500ng、1850ng；每一梯度注射两只雌虾，共注射了10只虾。以注射2μL PBS及未注射的虾为对照。将处理过的雌虾单独饲养，以防干扰，待其产卵及孵化。

3.  
外源DNA整合的检测：当胚胎发育到7~10d（搔状幼体前期至搔状幼体期），捞出雌虾，用镊子取附着于虾游泳足上的卵少许。首先用灭菌双蒸水清洗虾胚胎，留取10μL清洗水进行PCR扩增，以检测胚胎外是否残存有注射的DNA。为了彻底排除残留在胚胎外部的DNA片段污染的可能，再用20μg DNase I 37℃温育l h，用灭菌双蒸水清洗3次。将经上述处理过的胚胎分为5粒一组至1.5ml Eppendorf管，共5组，用酚-氯仿抽提及乙醇沉淀法分别提取基因组DNA。对提取的胚胎基因组DNA进行PCR，来检测虾胚胎中是否有目的DNA的整合。以胚胎基因组DNA为模板，用合成的sbwAFP特异序列为引物。如果有整合，则应能扩增出片段大小约310bp的sbwAFP片段。以PBS和灭菌双蒸水为模板作为阴性对照，60ng注射用质粒为模板作阳性对照。20μL反应体系中包括：100-200ng胚胎基因组DNA，引物各0.3μM，dNTPs 80μM，反应缓冲液（10x，含Mg²⁺）2μL，Tag酶1unit。反应程序为：94℃预变性4min，35个循环（94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸l min），最后72℃再延伸10min。程序结束后,每一PCR反应物取10μL进行2%琼脂糖凝胶电泳。

4.  
基因转移率的计算

每份提取试样含有5个胚胎的基因组DNA，每只注射雌虾被检测5个试样共25个胚胎。PCR检测为阳性的试样中可能仅有一个胚胎为阳性，也可能5个全是，由于无法得知具体数目，故按照最小值1个阳性胚胎计算，用PCR检测为阳性的试样数除以25，得到基因转移率的最小值。

结论：在对罗氏沼虾的基因改良过程中,通过精荚微注射，将目的基因直接注射到交配后的雌虾胸部腹面的精荚中，再由精子介导的简便高效的转基因技术，成功地将抗冻蛋白基因导入到罗氏沼虾的胚胎中，获得了16%以上的基因转移率。这一方法的建立，为进一步开展抱卵孵化的甲壳动物的分子遗传和发育生物学的研究以及育种工作的研究奠定了基础。