甘肃农业大学硕士研究生论文开题报告

（包括课题的研究意义，国内外研究现状分析，附主要的参考文献）

1.研究目的及意义

在我国，牦牛（Bos grunniens）主要生活在以青藏高原为主及其周围的高山和亚高山地区，其对空气稀薄、牧草生长期短、寒冷的生态环境条件具有很强的适应性，是当地畜牧业经济中不可缺少的畜种，同时在遗传上也是极为宝贵的基因库^[1]，素有“高原之舟”的称号^[2]。普通平原地区的黄牛移居高海拔地区后因空气中的氧分压过低会导致机体出现肺动脉高压（pulmonary
arterial hypertension，PAH）、右心肥厚等症状^[3]，肺经呼吸道与外界相通，是向外开放的器官，容易受到高原低氧环境的影响，从而引起各种急慢性高原病^[4]。PAH是一种严重的临床疾病，其发展与肺血管重构密切相关，表现为进行性肺血管重构，导致肺动脉压持续升高，最终导致右心衰竭。而牦牛作为长期生活在青藏高原等高海拔地区的代表性动物，其肺脏在形态结构和生理功能上经过长期的适应性并未表现出明显的肺动脉高压、右心肥厚和右心衰竭等症状^[5]。故牦牛是研究低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary
hypertension, HPH）防治的理想模型。张勤文等人^[6]研究发现，大通牦牛的肺动脉表现为随着血管管径的逐渐变细，平滑肌含量和平原黄牛相比越来越少，即肺大血管较厚有利于动脉射血，而小血管的管壁较薄则不容易产生肺动脉高压。陈秋生等^[7]研究发现，牦牛I型肺泡上皮菲薄，而且在某些部位出现间断，这些间断或是上皮的小孔，或是相邻上皮间的裂隙。它们都有利于牦牛比其它动物进行气体交换更容易。另外，与其它动物相比，牦牛气-血屏障厚度的绝对值约为猪、狗和绵羊的1/4，牦牛气-血屏障变薄，减少了气体中氧弥散时的阻力，便于低氧环境下的气体交换。牦牛的这些特点均有利于牦牛对高原低氧环境的适应^[8]。因此通过观察其从出生到成年期间适应高原低氧环境肺血管、肺泡的微观结构变化及组织结构特征，并探究牦牛肺脏低氧环境适应性的具体分子机制可进一步对低氧引起的肺动脉高压的治疗提供研究思路。

蛋白酪氨酸激酶／信号转导转录激活因子(JAK/STAT)通路是一种重要的信号转导通路，广泛参与细胞的増生、分化、调亡、免疫调节等病理生理过程^[9]。JAK激酶和STAT蛋白特异性表达于血管壁，并转导各种受体家族的细胞内信号，参与细胞凋亡相关因子、生长因子和血管活性肽的表达^[10]。研究发现，JAK-STAT信号通路激活能够调节血管内皮生长因子、血管紧张素Ⅱ(加全称，AngⅡ)的局部合成，参与高血压的发生发展^[11,12]，而高血压的主要特点是血压升高和由其导致的血管重构^[13]。肺血管平滑肌细胞（PASMC）是肺血管重构的主要效应细胞之一，研究发现，缺氧可诱导激活JAK2磷酸化信号换能器和转录激活因子3 (STAT3)， STAT3随后结合CCNA2启动子转录cyclin A2表达，从而促进PASMC增殖^[14]。另外，缺氧可诱导高达四倍的STAT3 磷酸化，使 PASMC 增殖增加了近两倍，由此证明了JAK2-STAT3通路参与了缺氧刺激下 PASMC 的激活和增殖^[15]。据报道，JAK2-STAT3 信号通路依赖于缺氧诱导的 HIF-1α表达^[16]。Chen等^[17]人发现缺氧后PASMCs中JAK2和STAT3明显激活，而JAK2/STAT3的激活可抑制PASMC细胞凋亡。另有研究表明，抑制miR-361-5p表达可通过靶向ABCA1和抑制JAK2/STAT3通路抑制PASMCs的增殖和迁移^[18]。Bai等^[19]人培养大鼠原代PASMC，发现缺氧刺激两小时后，PASMC中内源性细胞因子信号抑制因子SOCS3 mRNA被显著诱导。此外，在缺氧条件下，PASMC中强制表达SOCS3基因对STAT3酪氨酸磷酸化超过70%。SOCS3基因的过表达使缺氧诱导的PASMC增殖降低了约50%，这提示了STAT3依赖通路参与缺氧刺激下PASMC的激活和增殖，

以上都充分说明JAK/STAT通路参与了血管重构过程，但JAK/STAT信号通路在牦牛肺脏低氧适应性结构形成中发挥的作用鲜见报道，因此本试验以高原牦牛肺脏为研究对象，首先采用光镜、电镜、HE染色、VVG染色、重金属染色、免疫荧光共聚焦显微镜以及scRNA-seq等技术观察不同年龄段牦牛肺泡和肺泡上皮的显微结构特点，分析各发育时间点的肺泡变化特点，并采用免疫组织化学、Western blot和qRT-PCR等技术对JAK/STAT信号通路中JAK2、STAT3、CCNA2在不同年龄牦牛肺脏中的表达水平及分布特征进行研究，同时体外分离培养牦牛肺动脉平滑肌细胞，探讨低氧对牦牛肺动脉平滑肌细胞中JAK/STAT信号通路相关因子的影响，旨在探究JAK/STAT信号通路在牦牛肺脏低氧适应过程中发挥作用的具体分子机制，有助于阐明牦牛避免肺动脉高压发生的低氧适应机制，从而进一步为哺乳动物低氧适应性机制的研究提供一定的试验资料。

2.国内外研究现状分析

1.    
JAK/STAT信号通路的研究现状

JAK/STAT是一种重要的胞内信号转导通路，广泛介导多种生物过程。近些年来，Janus激酶(JAK)是一组细胞内酪氨酸激酶，在多种膜受体启动的信号转导中起着至关重要的作用^[20]。在哺乳动物中，JAK是由TYK2、JAK3、JAK2和JAK1组成的^[21]，JAK2、JAK1和TYK2在各种组织和细胞中广泛表达，而JAK3在骨髓和淋巴系统中表达^[22]。在功能上，JAKs由FERM、SH2、Pseudokinase和Kinase四个结构域组成^[20]。最重要的结构域是激酶结构域，它负责细胞因子和下游STAT分子的磷酸化^[23]。哺乳动物STAT家族共有7个成员，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6^[24]。在结构上，STATs由6个保守结构域组成：转录激活域、SH2结构域、DNA结合域、螺旋结构域、酪氨酸激活域(TAD)和氨基末端结构域^[25]。

作为JAK下游的蛋白，STAT在细胞质中以单体形式存在，可将细胞信号传导至细胞核内^[26]。当细胞因子与其相应受体结合时，通过JAK/STAT途径启动信号传导。受体细胞质部分的构象变化启动了JAK家族受体相关成员的激活，JAK激活后可催化受体上的酪氨酸残基磷酸化，并形成相应的STAT结合位点，STAT与该位点结合后发生磷酸化而被激活，活化的STAT与受体分离，二聚化，进入细胞核内与目的基因的启动子相结合，从而激活相应的基因转录和翻译，最终引发炎症反应，促进肺血管重构^[27]。据报道，JAK2和STAT3参与了与肺动脉重塑直接相关的过程，如平滑肌增殖、内皮功能障碍和炎症。这些细胞和分子过程在血管炎、动脉粥样硬化和PAH等几种血管疾病中很常见^[28,29]。Wang等研究发现在缺氧条件下的PASMCs中JAK1、JAK2、JAK3、p-STAT1和p-STAT3在mRNA和蛋白水平上的过表达^[30]，这也提示缺氧激活JAK/STAT信号通路，该通路可能参与缺氧性PASMC损伤的发病机制。此外，JAK2介导TGF-β诱导的肺动脉内皮细胞向间充质细胞和平滑肌细胞向肌成纤维细胞的转变，参与动脉重塑。也有研究发现，PAH患者中p-STAT3表达升高，在PAH的人肺动脉内皮细胞(HPAEC)和人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)中观察到 STAT3磷酸化^[31-33]。此外，PAH患者肺组织切片显示，p-STAT3在内皮、网状病变、同心内膜病变以及小动脉内皮中均有高表达^[31]。JAK2及其下游介质STAT3已被确定为成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中促纤维化作用和肺动脉重塑的细胞内介质^[34]。

2.    
细胞周期蛋白A2基因的研究现状

细胞周期蛋白A2（Cell cycle
regulator cyclin A2，CCNA2）是细胞周期蛋白家族中高度保守的成员之一，该蛋白家族与真核细胞的细胞周期呈同步周期性浓度升降，最先是从海胆胚胎中分离鉴定的，为相对分子质量50000蛋白质的一大家族，包括：周期蛋白质A、B、D、E、G及H。它们与关键的蛋白质激酶（细胞周期蛋白依赖性激酶，cyclin-dependent kinases, CDKs）结合，并调节它们的酶活性，从而帮助推动和协调细胞周期的进行。CCNA2与调节细胞周期和细胞衰老以及DNA复制和有丝分裂有关。细胞周期蛋白A是细胞周期过程中的重要调节因子，能促进细胞从G1期向S期转换，促进DNA的复制^[35]。它也是造血过程和胚胎细胞发育的核心调控因子^[36]。Cyclin A2编码在一个由8个外显子组成的7kpb基因(Cyclin A2或ccna2)中，该基因位于人类4号染色体(小鼠3号染色体)上，导致两个mRNA的合成，分别为1.8 Kb和2.7 Kb，仅在它们的3 ' -非翻译区(3 ' UTR)不同。细胞周期蛋白A2 mRNA水平在G1/S期增加，并在S期达到峰值，这是由于细胞进入S期时转录抑制的周期性缓解^[37-39]。细胞周期蛋白A2的转录调节受生长因子、TGF-β等外周信号以及细胞与细胞外基质的相互作用调节^[40-42]。PAH是一种增殖性疾病，与肺动脉平滑肌细胞增殖增强和细胞凋亡抑制有关。在Zhang等研究中提示cyclin A2可能是JAK2/STAT3下游调控缺氧损伤后HPASMCs增殖的新靶点，研究表明在缺氧诱导的激活下，JAK2磷酸化STAT3, STAT3随后易位到细胞核中，与CCNA2启动子结合转录细胞周期蛋白A2的表达，从而促进PASMC增生和肺血管重构^[14]。

参考文献：

[1]     朱世海,张国顺,袁琦.青海两种生态类型牦牛对环境适应的生理特性比较[J].黑龙江畜牧兽医,2013,(01):152-153.

[2]     魏雅婷. 肺离子细胞相关因子CFTR、ATP6V0D2和ATP6V1C2在不同年龄牦牛肺脏内的分布和表达研究[D].甘肃农业大学,2021.

[3]     Rabinovitch M,
Gamble W, Nadas AS, et al. Rat pulmonary circulation after chronic
hypoxia: hemodynamic and structural features. Am J Physiol. 1979;236
(6):H818-27.

[4]     赵振,朱智勇,侯滨,张月琴,李容,曾维俊,多杰.不同高原低氧暴露时间下大鼠肺泡组织细胞自噬变化研究[J].高原医学杂志,2021,31(01):1-6.

[5]    
袁青妍,谢庄.动物对高原低氧的适应性研究进展[J].生理科学进展,2005,(02):179-182.

[6]    
张勤文,俞红贤,李莉等.成年大通牦牛肺血管低氧适应的组织学特点[J].中国兽医杂志,2016,52(09):28-31.

[7]     陈秋生,冯霞,姜生成.牦牛肺脏高原适应性的结构研究[J].中国农业科学,2006(10):2107-2113.

[8]     Meban C.
Thickness of the air-blood barriers in vertebrate lungs. Journal of Anatomy,
1980,131(2):299-307.

[9]     Han J, Ye S,
Zou C, et al. Angiotensin II Causes Biphasic STAT3 Activation Through TLR4 to
Initiate Cardiac Remodeling. Hypertension. 2018;72 (6):1301-1311.

[10]  Wahnschaffe L,
Braun T, Timonen S, et al. JAK/STAT-Activating Genomic Alterations Are a
Hallmark of T-PLL. Cancers (Basel). 2019;11 (12): null.

[11] 

[12]  Didion SP. New
Insights into Mechanisms Associated with Angiotensin II-Induced Vascular
Hypertrophy and Remodeling. Hypertension. 2016;67 (3):501-3.

[13]  Patel VB, Zhong
JC, Fan D, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 is a critical determinant
of angiotensin II-induced loss of vascular smooth muscle cells and adverse
vascular remodeling. Hypertension. 2014;64 (1):157-64.

[14]  Zhang L, Wang
Y, Wu G, et al. Blockade of JAK2 protects mice against hypoxia-induced
pulmonary arterial hypertension by repressing pulmonary arterial smooth
muscle cell proliferation. Cell Prolif. 2020;53 (2): e12742.

[15]  Bai L, Yu Z,
Qian G, et al. SOCS3 was induced by hypoxia and suppressed STAT3
phosphorylation in pulmonary arterial smooth muscle cells. Respir Physiol
Neurobiol. 2006;152 (1):83-91.

[16]  Liu T, Li Y,
Lin K, et al. Regulation of S100A4 expression via the JAK2-STAT3 pathway in
rhomboid-phenotype pulmonary arterial smooth muscle cells exposure to
hypoxia. Int J Biochem Cell Biol. 2012;44 (8):1337-45.

[17]  Yerabolu D,
Weiss A, Kojonazarov B, et al. Targeting Jak-Stat Signaling in Experimental
Pulmonary Hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 2021;64 (1):100-114.

[18]  Zhang X, Shao
R, Gao W, et al. Inhibition of miR-361-5p suppressed pulmonary artery smooth
muscle cell survival and migration by targeting ABCA1 and inhibiting the
JAK2/STAT3 pathway. Exp Cell Res. 2018;363 (2):255-261.

[19]  Bai L, Yu Z,
Qian G, et al. SOCS3 was induced by hypoxia and suppressed STAT3
phosphorylation in pulmonary arterial smooth muscle cells. Respir Physiol
Neurobiol. 2006;152 (1):83-91

[20]  Bousoik E,
Montazeri Aliabadi H. "Do We Know Jack" About JAK? A Closer Look at
JAK/STAT Signaling Pathway. Front Oncol. 2018; 8:287.

[21]  Schindler C, Darnell JE. Transcriptional responses to polypeptide
ligands: the JAK-STAT pathway. Annu Rev Biochem. 1995; 64:621-51.

[22]  Gnanasambandan
K, Sayeski PP. A structure-function perspective of Jak2 mutations and
implications for alternate drug design strategies: the road not taken. Curr
Med Chem. 2011;18 (30):4659-73.

[23]  Liu J, Wang F,
Luo F. The Role of JAK/STAT Pathway in Fibrotic Diseases: Molecular and
Cellular Mechanisms. Biomolecules. 2023;13 (1).

[24]  Böhmer FD,
Friedrich K. Protein tyrosine phosphatases as wardens of STAT signaling.
JAKSTAT. 2014;3 (1): e28087.

[25]  Yu H, Jove R.
The STATs of cancer--new molecular targets come of age. Nat Rev Cancer.
2004;4 (2):97-105.

[26]  余仙娟,沈亚青,徐俭朴等.基于JAK-STAT信号通路研究保肺定喘汤干预COPD肺血管重构的分子机制[J].浙江中医药大学学报,2020,44(12):1210-1214+1221.

[27]  He J, Bao Q,
Zhang Y, et al. Yes-Associated Protein Promotes Angiogenesis via Signal
Transducer and Activator of Transcription 3 in Endothelial Cells. Circ Res.
2018;122 (4):591-605.

[28]  Zhang H,
Watanabe R, Berry GJ, et al. Inhibition of JAK-STAT Signaling Suppresses
Pathogenic Immune Responses in Medium and Large Vessel Vasculitis.
Circulation. 2018;137 (18):1934-1948.

[29]  Liu C, Arnold
R, Henriques G, et al. Inhibition of JAK-STAT Signaling with Baricitinib Reduces
Inflammation and Improves Cellular Homeostasis in Progeria Cells. Cells.
2019;8 (10): null.

[30]  Wang GS, Qian
GS, Zhou DS, et al. JAK-STAT signaling pathway in pulmonary arterial smooth
muscle cells is activated by hypoxia. Cell Biol Int. 2005;29 (7):598-603.

[31]  Masri FA, Xu W,
Comhair SA, et al. Hyperproliferative apoptosis-resistant endothelial cells
in idiopathic pulmonary arterial hypertension. Am J Physiol Lung Cell Mol
Physiol. 2007;293 (3): L548-54.

[32]  Courboulin A,
Paulin R, Giguère NJ, et al. Role for miR-204 in human pulmonary arterial
hypertension. J Exp Med. 2011;208 (3):535-48.

[33]  Yamamura A,
Nayeem MJ, Al Mamun A, et al. Platelet-derived growth factor up-regulates Ca
2+ -sensing receptors in idiopathic pulmonary arterial hypertension. FASEB J.
2019;33 (6):7363-7374.

[34]  Roger I, Milara
J, Montero P, et al. The Role of JAK/STAT Molecular Pathway in Vascular
Remodeling Associated with Pulmonary Hypertension. Int J Mol Sci. 2021;22
(9): null.

[35]  Bendris N,
Loukil A, Cheung C, et al. Cyclin A2: a genuine cell cycle regulator? Biomol
Concepts. 2012;3 (6):535-43.

[36]  Arsic N,
Bendris N, Peter M, et al. A novel function for Cyclin A2: control of cell invasion
via RhoA signaling. J Cell Biol. 2012;196 (1):147-62.

[37]  Zwicker J,
Lucibello FC, Wolfraim LA, et al. Cell cycle regulation of the cyclin A,
cdc25C and cdc2 genes is based on a common mechanism of transcriptional
repression. EMBO J. 1995;14 (18):4514-22.

[38]  Huet X, Rech J,
Plet A, et al. Cyclin A expression is under negative transcriptional control
during the cell cycle. Mol Cell Biol. 1996;16 (7):3789-98.

[39]  Coisy M, Roure
V, Ribot M, et al. Cyclin A repression in quiescent cells is associated with
chromatin remodeling of its promoter and requires Brahma/SNF2alpha. Mol Cell.
2004;15 (1):43-56.

[40]  Philips A, Roux
P, Coulon V, et al. Differential effect of Rac and Cdc42 on p38 kinase
activity and cell cycle progression of nonadherent primary mouse fibroblasts.
J Biol Chem. 2000;275 (8):5911-7.

[41]  Barlat I,
Henglein B, Plet A, et al. TGF-beta 1 and cAMP attenuate cyclin A gene
transcription via a cAMP responsive element through independent pathways.
Oncogene. 1995;11 (7):1309-18.

[42]  Alabert C,
Rogers L, Kahn L, et al. Cell type-dependent control of NF-Y activity by
TGF-beta. Oncogene. 2006;25 (24):3387-96.

（包括研究目标、研究内容、拟采取的研究方法、技术路线、试验方案及可行性分析和预期的研究进展）

（一）研究目标

1．通过采用光镜、电镜、HE染色、VVG染色、重金属染色、免疫荧光共聚焦显微镜以及scRNA-seq等技术观察不同年龄段牦牛肺泡和肺泡上皮的显微结构特点，分析各发育时间点的变化特点，记录各个阶段肺泡的结构特征、肺泡数量、单个肺泡面积、肺泡隔厚度、肺泡内弹力纤维的数量、气血屏障、毛细血管数量、肺泡孔数量等  

2．阐明析不同年龄牦牛肺组织中JAK/STAT信号通路的关键因子JAK2、STAT3及CCND1的表达和定位情况。

3．探究低氧对牦牛肺动脉平滑肌细胞中JAK/STAT信号通路相关因子JAK2、STAT3及CCND1的表达影响，为研究低氧诱发的肺动脉高压和肺血管重构等疾病奠定基础。

（二）研究内容

         
1.        
选取健康的初生、3月龄、6月龄、9月龄以及1岁牦牛肺脏组织样品作为研究对象  

         
2.        
采用光镜、电镜、HE染色、VVG染色、重金属染色、免疫荧光共聚焦显微镜以及scRNA-seq等技术观察不同年龄段牦牛肺泡和肺泡上皮的显微结构特点，分析各发育时间点的变化特点，记录各个阶段肺泡的结构特征、肺泡数量、单个肺泡面积、肺泡隔厚度、肺泡内弹力纤维的数量、气血屏障、毛细血管数量、肺泡孔数量

         
3.        
采用免疫组织化学法和组织免疫荧光法检测JAK/STAT信号通路的关键因子以及CCND1在不同年龄段牦牛肺脏的表达分布，从分子水平上了解各因子在牦牛不同发育节点的分布差异，以及相互作用关系。

         
4.        
使用qRT-PCR和Western blot技术探讨低氧对牦牛肺动脉平滑肌细胞中JAK/STAT信号通路相关因子在mRNA和蛋白水平上的表达影响，再通过使用JAk2抑制剂ruxolitinib来磷酸化肽的差异特征用于预测牦牛肺动脉平滑肌细胞中酪氨酸激酶活性的变化。并通过图象分析软件进行相对定量分析。

（三）拟采取的研究方法

          
1.       
组织切片技术和HE染色、重金属染色、VVG染色

          
2.       
单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）

          
3.       
免疫组织化学技术（IHC）

          
4.       
免疫组织荧光（IF）

          
5.       
免疫印迹技术（Western-blot）

          
6.       
实时荧光定量技术（qRT-PCR）

          
7.       
统计学分析方法

主要仪器与设备

生物组织切片机、低温恒冷箱切片机、全自动脱水机、石蜡包埋机、烘片机、DP71摄像和图像分析系统、转膜仪、摇床、化学发光仪、PCR仪、电泳仪、实时荧光定量PCR仪。

Trizol^®
RNA提取试剂盒、Promega反转录试剂盒、Takara实时荧光定量试剂盒、SP-0023免疫组化染色试剂盒等。

3.        
主要实验步骤

3.1  光镜技术，电镜技术观察不同年龄段牦牛肺泡显微结构

a）不同发育阶段牦牛肺脏的组织样品经4%多聚甲醛固定，4℃保存带回试验室。

b）样品经酒精脱水、石蜡包埋、切片后进行HE染色，采用光镜技术观察初生、3月龄、6月龄、9月龄和1岁牦牛肺泡组织结构。

c）不同发育阶段牦牛肺脏的组织样品经2.5%的戊二醛溶液4℃固定，经酒精脱水、包埋、切片后进行重金属染色，采用电镜技术初生、3月龄、6月龄、9月龄和1岁牦牛肺泡上皮显微组织结构。

3.2  免疫组织化学法(IHC)，组织免疫荧光(IF)，检测观察JAK2、STAT3、p-JAK2/STAT3、CCNA2在初生（1-6日龄）、幼年（1-2岁）、成年（3-6岁）及老年（7-10岁）四个年龄组牦牛肺脏的表达分布

a）运用免疫组织化学法、方法观察JAK2、STAT3、p-JAK2/STAT3、CCNA2在初生（1-6日龄）、幼年（1-2岁）、成年（3-6岁）及老年（7-10岁）牦牛肺脏中的阳性表达。

3.3  Western-blot、qPCR技术检测初生（1-6日龄）、幼年（1-2岁）、成年（3-6岁）及老年（7-10岁）牦牛肺脏中JAK2、STAT3、p-JAK2/STAT3、CCNA2在蛋白和mRNA水平的表达量

a）提取初生（1-6日龄）、幼年（1-2岁）、成年（3-6岁）及老年（7-10岁）牦牛肺脏的蛋白样品，在100℃水浴锅中将蛋白变性。

b）运用Western-blot技术检测JAK2、STAT3、p-JAK2/STAT3、CCNA2在蛋白水平的表达情况。

c）运用qPCR技术检测JAK2、STAT3、p-JAK2/STAT3、CCNA2在mRNA水平的表达情况。

3.4  将实验所得的数据整理并进行统计学分析

4.        
可行性分析

4.1 可行性

a）本研究受国家自然科学基金资助，有足够的经费支持。

b）本实验室具备开展该科研所需的仪器设备及相关实验技术支持，预期可以按照研究方案获得研究结果。

c）本实验室已对牦牛肺脏组织开展过大量的研究，并且已经了解相关理论基础，掌握相关实验技能。

 4.2 可能遇到的问题

a）采回的组织样品固定时间较长，可能会影响相应细胞因子的活性。

b）没有针对牦牛的特异性抗体，因此选用的抗体需要仔细筛选。

5.        
预期的研究进展

5.1 计划进度安排

2022年9月-2023年5月：查阅收集相关资料，熟练掌握组织切片的制作过程，熟悉和掌握基本的操作技术。

2023年6月-2024年9月：收集足够的试验样本，运用HE染色、IHC、Western-blot、
qRT-PCR等实验技术对组织样品进行研究.

2024年10月-2024年12月：整理实验结果，进一步采用各种分析软件进行分析，撰写学位论文。

2025年1月-2025年4月：撰写毕业论文，准备论文答辩。

5.2 预期的研究成果

通过光镜以及电镜的观察，了解了不同年龄段牦牛肺泡以及肺泡上皮细胞的显微结构，发现不同年龄段牦牛的肺泡结构存在差异，推测这种差异是牦牛肺脏适应高原低氧环境的生理结构基础，为以后研究哺乳动物低氧适应性的调控机制提供一定的研究资料。

确定了JAK2、STAT3、p-JAK2/STAT3、CCNA2在初生（1-6日龄）、幼年（1-2岁）、成年（3-6岁）及老年（7-10岁）牦牛肺脏中的表达和分布，为研究牦牛肺脏适应低氧环境提供可靠依据。另外，由于JAK2、STAT3、p-JAK2/STAT3、CCNA2在低氧引起的肺动脉高压以及血管重构中起着重要作用，所以对于相关疾病的治疗具有极其重要的指导意义。

支出科目

金额（万元）

计算根据及理由

1、业务费

0.5

采样费、车旅费、论文版面费

2、试验材料费

2.0

抗体购买、所需试剂盒、实验药品、耗材

3、仪器设备费

0.3

部分设备购置及设备维修

4、其它

0.2

论文打印、答辩等

合计

3.0

姓  名

研究方向

职称、职务

工 作 单 位

签  名

参加开题报告论证会的总人：                             其中教师人数：

（包括选题的理论、实践意义，试验设计方案，研究的预期结果及学生分析、综合问题的能力、表达能力等方面做出评议，并提出修改意见及是否通过的建议）。

论证主持人签字：                                        年   月  
日

负责人：                                                   
（盖章）

年  月  日